Acoustophorèse assistée par aptamère pour la séparation microfluidique de bactéries à Gram négatif

Résumé

Source : Choi, H. J., et al. Acoustophorèse microfluidique pour la séparation par écoulement continu de bactéries à Gram négatif à l’aide de billes d’affinité d’aptamères. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo montre la méthode de séparation sélective des bactéries à Gram négatif d’un échantillon bactérien mixte à l’aide de microbilles enrobées d’aptamères et de forces acoustiques à l’intérieur d’une puce microfluidique.

Protocole

1. Configuration et fonctionnement de l’acoustophorèse
   1. Connectez les tubes en polyétheréthercétone (PEEK) aux deux entrées pour l’injection de deux échantillons et d’un tampon, et aux deux sorties pour la collecte et le déchargement des déchets (Figure 1).
   2. Remplissez manuellement le canal d’acoustophorèse microfluidique avec de l’eau déminéralisée sans bulles à l’aide d’une seringue de 10 ml.
   3. Préparez un régulateur de pression de précision avec deux canaux de sortie ou plus pour contrôler le débit du fluide. Ensuite, remplissez à moitié les flacons d’échantillon et de tampon, respectivement, avec deux trous dans leurs bouchons, et connectez-les à l’entrée de la puce.
      REMARQUE : Un régulateur de pression de précision avec deux canaux de sortie ou plus peut être remplacé par plusieurs régulateurs de pression de précision. À l’entrée du tampon, un tampon capable de générer un flux laminaire qui empêche l’échantillon de se déplacer vers le centre lors de l’injection de l’échantillon est injecté par l’intermédiaire d’un régulateur de débit.
   4. Après avoir préparé l’appareil, injectez l’échantillon et le tampon en appliquant une pression de 2 kPa à l’entrée de l’échantillon et de 4 kPa à l’entrée du tampon à l’aide du dispositif de contrôle de pression de précision.
      REMARQUE : À ce stade, pour un écoulement laminaire régulier, la pression d’injection du tampon doit être supérieure à la pression d’injection de l’échantillon. Le débit est contrôlé par un régulateur de débit fixé à l’aspirateur relié au canal d’entrée.
   5. Concentrez-vous sur une bille à l’aide du transducteur piézoélectrique (PZT) pour la déplacer au centre du canal microfluidique tout en vérifiant au microscope.
      REMARQUE : Plus la perle est grande, plus l’effet sur la forme d’onde est important, il est donc plus facile de l’aligner avec le point du nœud. Un générateur de fonctions avec un amplificateur applique de la puissance au PZT pour générer une onde sinusoïdale dans le microcanal. Étant donné que les parties supérieure et inférieure du microcanal sont en verre, l’onde sinusoïdale générée est réfléchie et crée un point de nœud.
   6. À l’aide d’un générateur de fonctions à canal unique, générez une fréquence de résonance de 3,66 MHz et amplifiez un signal typique de 16 dB (environ neuf fois) à l’aide d’un amplificateur de puissance (Figure 1).
      REMARQUE : La fréquence de résonance de l’actionneur doit correspondre à la taille du canal, car le canal est carré, le PZT fonctionne à une fréquence précise pour créer un seul nœud.
   7. Observez les processus de séparation et d’enrichissement sur la puce acoustofluidique à l’aide d’un microscope à fluorescence et d’une caméra à grande vitesse fonctionnant à 1 200 images par seconde (images par seconde).
   8. Quantifiez et analysez la présence ou l’absence de bactéries à Gram négatif (GN) et de bactéries à Gram positif (GP) en vérifiant les images prises avec la caméra du microscope à fluorescence des billes liées aux bactéries et des bactéries rejetées par les échantillons de collecte et de sortie des déchets.
      REMARQUE : Les microbilles avec tampon, les bactéries et les aptamères passent par le canal principal, et les microbilles sont alignées au centre via l’acoustophorèse dans la puce induite par le PZT. Enfin, les microbilles qui ont lié les bactéries GN sont collectées à la sortie de collecte, et les bactéries non collectées sont évacuées par la sortie des déchets.

Résultats

Figure 1 : Schéma du système acoustofluidique utilisé pour séparer et collecter les cellules. L’échantillon ou la solution tampon est injecté dans l’orifice d’entrée par l’intermédiaire du régulateur de débit. Pour le centrage ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 μm Microbilles enrobées de streptavidine	Bang Laboratories	CP01007	Perles d’affinité Aptamer Aptamer
	Integrated DNA Technologies	GN3-6'ARN	pour la conjugaison bactérienne
Escherichia coli DH5α	KCTC	KCTC2571	Bactéries cibles
Générateur fonctionnel	GW Instek	AFG-2225	Fréquence de génération
Caméra haute vitesse	Photron	FASTCAM Mini	Observation de la séparation
KOVAX-SYRINGE 10 mL Seringue	Koreavaccine	22G-10ML	Remplissez le canal d’acoustophorèse microfluidique avec de l’eau déminéralisée sans bulles.
Microscope	Olympus Corp.	IX-81	Observation de la séparation
PEEK Tubes	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	Injecter ou collecter des particules
Transducteur piézoélectrique	Fuji Ceramics	C-213	Générer une onde spécifique dans le canal
Amplificateur de puissance	Amplificateur Recherche	75A250A	Amplifier la fréquence
Régulateur de pression/μflucon	AMED	AMED-μflucon	Contrôle de la pression atmosphérique/régulateur de débit